Bakteriophagen – Forschung und Therapie: Die ersten 100 Jahre

Bacteriophage Attack

Zunehmende Antibiotika-Resistenzen machen es nötig, neue Zugänge in der Therapie von bakteriellen Erkrankungen zu finden. Eine Möglichkeit dazu ist die Behandlung mit Bakteriophagen, die bereits vor einem Jahrhundert entdeckt wurde. Neueste Forschungsergebnisse zeigen, dass diese Methode weit mehr ist als sentimentaler Retro-Chic…

Baktriophagen

 

Alle Bakteriophagen sind Viren – aber nicht alle Viren sind Bakteriophagen. Dafür sind Bakteriophagen einfach Phagen – der Zusatz „Bakterien“ wird heutzutage gerne weggelassen, da „Phagen“ ausschließlich mit der bakteriellen Wirtsspezifität in Zusammenhang gebracht wird.

Viren können Eukaryoten (Pflanzen, Pilze, Tiere) wie Prokaryoten (Bakterien und Archaea) befallen. Phagen sind Viren, die nur Bakterien als Wirte haben. Seit der Ausgliederung der Archaea (damals noch bezeichnet als „Archaebakterien“ neben den „Eubakterien“ im Reich der Monera = Prokaryoten) aus den Bakterien im Jahr 1990 (Woese CR, Kandler O, Wheelis ML. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1990;87(12):4576–4579), geht der Trend in der Bezeichnung zu Archaeviren anstatt Archaephagen (Stephen T. Abedon, Kelly L. Murray. Archaeal Viruses, Not Archaeal Phages: An Archaeological Dig. Archaea. 2013; 2013: 251245).

Während bereits Aulus Cornelius Celsus (* um 25 v. Chr.; † um 50 n. Chr.) den Viren (Virus = Gift, Schleim) ihren Namen gab, dauerte es bis 1918 als Félix Hubert d’Hérelle (1873-1949) den Begriff „Bakterienfresser“ (Bakteriophage, oft mit dem griechischen Buchstaben Φ abgekürzt) kreierte (d’Hérelle F. Sur le rôle du microbe filtrant bacteriophage dans la dysenterie bacillaire. CR Acad Sci. 1918; 167: 970). Er dachte damals, es gäbe nur eine Bakteriophagen-Familie mit verschiedenen Arten. Heute ist – dank fleißiger Forschungstätigkeit über viele Jahr(zehnt)e hinweg – bekannt, dass nicht nur eine Bakteriophagen-Familie existiert. Bereits 1923 wurde dementsprechend der Plural „Phagen“ eingeführt (Ackermann HW. Phage or Phages. Bacteriophage. 2011 Jan;1(1):52-53).

Heute gelten als Entdecker der Bakteriophagen der Brite Frederick William Twort (1877-1950) mit seiner 1915 erschienen Arbeit: „Twort FW. An investigation on the nature of ultra-microscopic viruses. Lancet. 1915 Dec; 2: 1241 – 1243“ und der Kanadier Félix Hubert d’Hérelle (1873-1949), der 1917 (unabhängig von Twort’s Forschung) seine Studienergebnisse publizierte: „d’Hérelle F. Sur un microbe invisible antagoniste des bacilles dysentériques. C R Acad Sci Ser D. 1917; 165: 373–375“. Dennoch werden in der Literatur Forschungsveröffentlichungen aus den Jahren ab 1895 zitiert, welche sich mit der Identifikation von Phagen vor 1915 auseinandersetzen sollen. Im Paper „Bacteriophage prehistory: Is or is not Hankin, 1896, a phage reference?“ werden 30 dieser Vorschläge aufgelistet und die Rolle der Studien von Ernest Hanbury Hanking (1865-1939) diskutiert (Abedon ST, Thomas-Abedon C, Thomas A, Mazure H. Bacteriophage prehistory: Is or is not Hankin, 1896, a phage reference? Bacteriophage. 2011 May;1(3):174-178).

Derzeit sind 12 verschiedene Bakteriophagen-Familien bekannt :

 

Familie 

Gattung Nukleinsäure Beispiele
 

behüllte Phagen

Plasmaviridae Plasmavirus zirkulär dsDNA Acholeplasma Phage
Cystoviridae Cystovirus segmentiert dsRNS Φ6
Lipothrixviridae Lipothrixvirus linear dsDNA Thermoproteus Phage 1, Acidianus filamentous virus 1
 

unbehüllte Phagen

Inoviridae Inovirus zirkulär ssDNA Coli Phage fd
Plectrovirus Acholeplasma Phage
Leviviridae Levivirus linear ssDNA Coli Phage MS2
Allolevivirus Coli Phage Qbeta
Microviridae Microvirus zirkulär ssDNA Coli Phage ΦX174
Spirovirus Spiroplasma Phage
Myoviridae linear dsDNA Coli Phage T4, Mu, PBSX, P1Puna-like, P2, I3, Bcep 1, Bcep 43, Bcep 78
Corticoviridae Corticovirus zirkulär dsDNA PM2
Podoviridae linear dsDNA Coli Phage T7, T3 phage, P22, P37
Siphoviridae Lambda Phagen Gruppe linear dsDNA Coli Phage Lambda, T5 phage, phi, C2, L5, HK97, N15
Sulpholobus shibatae virus zirkulär dsDNA SSV-1
Tectiviridae Tectivirus linear dsDNA Phage PRD1

(Ergänzt und modifiziert nach: Qadir MI. Review: Phage therapy: A modern tool to control bacterial infections. Pak J Pharm Sci. 2015 Jan;28(1):265-70.)

 

Phagen haben zwei verschiedene Vermehrungswege nach der Infektion eines Bakteriums evolviert:

1.) Sie können sich durch Nutzung der bakteriellen Enzyme vermehren (lytischer Zyklus = virulenter Zyklus) und anschließend – zum Zwecke der Freisetzung – das Bakterium töten, indem die Zellwand desselben enzymatisch partiell aufgelöst wird oder

2.) sie können ihre Erbinformation in die bakterielle Nucleinsäure integrieren (dann als „Prophagen“ bezeichnet), wobei sie sich mit dem Bakterium mitvermehren (lysogener Zyklus = latente Phase), also nur mit der bakteriellen Replikation und Zellteilung. Sollten sich die Umgebungszustände für das Bakterium verschlechtern und dieses vielleicht absterben, so haben Viren die Fähigkeit, vom lysogenen in den lytischen Zustand zu wechseln – dabei nehmen sie oft große Teile des bakteriellen Wirtsgenoms mit. So können sie nun selbst über Resistenzen gegen bakterielle Abwehrmechanismen verfügen und andererseits horizontalen Gentransfer (Transduktion) zwischen unterschiedlichen Bakterienstämmen bewirken, wenn sie neuerlich in einem anderen Wirt einen lysogenen Zyklus beginnen.

Temperente Phagen haben die Fähigkeit, zwischen dem lysogenen und dem lytischen Zyklus wechseln zu können (Beispiel: Φλ). Daher sollten diese Bakteriophagen nie zu einer Therapie herangezogen werden. Eine beträchtliche Anzahl an bakteriellen Humanpathogenen verfügen nur deshalb über Virulenz, da Prophagen sich in ihr Genom integriert haben (Brüssow H. Phage therapy: the Escherichia coli experience. Microbiology. 2005 Jul;151(Pt 7):2133-40. Review).

Virulente Phagen dagegen verbleiben immer (= obligat) im lytischen Zyklus (Beispiele: T-Phagen, MS2). Sie besitzen keine Integrasen und können daher nicht in das Wirtsgenom integrieren. T4 Phagen zerstören sogar die bakterielle Wirts-DNA während des Infektionsprozesses (Transduktion dadurch unmöglich). Daher eignen sie sich für die Phagentherapie – und hier besonders die Gruppe der T4-like Coliphagen, denn bei ihnen wurden bis dato noch keine für Toxine codierenden Gene gefunden. Konträr dazu wurden bei der λ-like Phagen-Gattung (Temperenz!) Siphoviridae Virulenzfaktoren beschrieben (Brüssow H. Phage therapy: the Escherichia coli experience. Microbiology. 2005 Jul;151(Pt 7):2133-40. Review).

Das Phagen-Genom zeigt – genauso wie jenes der Bakterien – eine hohe Mutationstendenz. Dadurch ist es beiden möglich, Resistenzen zu entwickeln als auch vorhandene Resistenzen zu überwinden. Dies ist ein ungeheurer Vorteil der Bakteriophagen gegenüber Antibiotika.

Überdies sind Bakteriophagen extrem Wirt-spezifisch (eine ideale Voraussetzung für die „personalisierte Medizin“ sowie für vorbeugende Maßnahmen wie z.B. zur Desinfektion) und beeinflussen nicht die restliche Mikroflora. Das ist auch ein Grund dafür, dass eine Phagentherapie sicher und relativ nebenwirkungsfrei ist. Allerdings kann es vorkommen, dass das Immunsystem Antikörper gegen Phagen bildet und so ein Phagen-Stamm mitunter kein zweites Mal im gleichen Organismus eingesetzt werden kann (Kucharewicz-Krukowska A, Slopek S. Immunogenic effect of bacteriophage in patients subjected to phage therapy. Arch Immunol Ther Exp. 1987;5:553–561). Da einerseits das Immunsystem mehrere Tage für die Produktion von Antikörpern benötigt und die Vermehrung der Phagen im Organismus sowie die Wirkung dieser auf die (pathogenen) Bakterien viel schneller abläuft (Sulakvelidze A, Alavidze Z, and Morris JG Jr. Bacteriophage Therapy. Antimicrob Agents Chemother. 2001 Mar; 45(3): 649–659. Review) und andererseits eine riesige Anzahl an Phagen zur Verfügung steht, ist dieses Problem von untergeordneter Bedeutung. So sollen auf der Erde geschätzt 1030 bis 1032 virale Partikel vorhanden sein (Brüssow H, Kutter E. Phage Ecology. In: Kutter E, Sulakvelidze A (Hrsg.): Bacteriophages – Biology and Applications. CRC Press. Boca Raton, Fla./USA 2004), wobei 1 ml Ozeanwasser durchschnittlich 107 Phagen-Partikel enthält (Bergh O, Børsheim KY, Bratbak G, Heldal M. High abundance of viruses found in aquatic environments. Nature. 1989 Aug 10;340(6233):467-8). Dementsprechend ist es leicht möglich, bei einer neuerlichen Phagentherapie einen anderen Phagenstamm zu wählen, der für das Immunsystem noch unbekannt ist, aber dennoch gut gegen das spezifische Bakterium wirkt.

Das „Phage Therapy Center“ in Tiflis beispielsweise bietet auf seiner Homepage (http://www.phagetherapycenter.com/pii/PatientServlet?command=static_conditions&language=0) ein weites Spektrum an Behandlungsmöglichkeiten im Rahmen einer personalisierten Phagen-Medizin an.

Ein besonders attraktiver Aspekt der Phagentherapie im Allgemeinen ist, dass mit dem/den selben Phagen Mensch und Tier wie auch biologische Dünger und agrikulturelle Flächen behandelt werden könnten. Dadurch ist eine zielgerichtete Eliminierung eines Bakterienstammes ohne Schädigung der übrigen Bakterienflora des Einsatzgebietes möglich.

 

 

 

Phagentherapie

 

Die Anwendung einer Therapie mit Phagen kann auf 2 Arten erfolgen:

  1. passiv – d.h. die initial verabreichte Dosis ist ausreichend um alle Pathogene zu eliminieren oder
  2. aktiv – die Konzentration an eingesetzten Phagen ist geringer, sie vermehren sich aber in vivo auf die nötige Menge.

Die Lyophilisierung (Trocknung) von Phagen erwies sich als vorteilhaft im Vergleich zu Flüssigpräparaten – die Bakteriophagen zeigen eine höhere Stabilität, die Einnahme als Tablette ist für den Konsumenten einfacher und die Verpackungsgröße des Produktes ist kleiner.

Selbst wiederholtes Einfrieren und Auftauen induzierte keine Schäden in den Phagen.

Die Aktivität von Phagen bei einem pH-Wert niedriger als 3,5 ist – je nach Stamm – unterschiedlich. Dennoch dokumentierten Studien, dass eine entsprechend erhöhte Anzahl an Phagen im Präparat den Erfolg bei Magensäure-sensitiven Bakteriophagen gewährleistete. Sobald die Phagen den Magen passiert hatten und in das basische Milieu des Dickdarmes gelangten, vermehrten sie sich in den Wirtsbakterien ausreichend.

Eine Lagerung von Bakteriophagen bei Temperaturen bis 55 °C schränkte ihre antibakterielle Wirkung nicht ein, sondern ließ sie nach 14 Monaten weiterhin aktiv sein.

Die Verträglichkeit für den Menschen war selbst während der anfänglich noch nicht sehr ausgereiften Phagen-Produktion gegeben, als noch Debris von lysierten E. coli im oral verabreichten Produkt zu finden war. Das deutet darauf hin, dass der Darm gegenüber Endotoxinen (das sind bakterielle, chemische Abwehrstoffe, die nach dem Platzen der Zellwand frei werden) relativ wenig sensitiv ist.

Es finden sich in der Literatur Experimente, die zeigten, dass Phagen sogar die Blut-Hirnschranke überwinden konnten und sich bei vorhandenem Wirt im Gehirn vermehrten (Level im Gehirn höher als im Serumspiegel).

Die Wirkungsschwelle von Phagen konnte anhand von Verdünnungsserien auf 10:1 = Bakterium:Phage bei Injektionen festgesetzt werden.

Interessanterweise waren in vitro und in vivo lytische Aktivität korrespondierend, sodass anhand von Labor-Versuchen die Wirksamkeit (im humanen/tierischen Organismus oder bei Ausbringung auf Ackerflächen und zur Desinfektion) eines Phagenstammes recht gut vorausgesagt werden kann.

Sobald die Bakteriophagen die spezifischen Bakterienstämme lysiert haben, verschwinden sie relativ rasch aus dem menschlichen/tierischen Organismus.

Neben Tierversuchen (z.B. in Hühnern, Mäusen, Kälbern, Schafen und Schweinen) gab es auch Wirksamkeitsstudien in Menschen:

  • So wurde im Jahr 1963 zirka der Hälfte von 30769 Kindern im Alter zwischen 6 Monaten und 7 Jahren in Tiflis Phagenpräparate zur Vorbeugung kindlicher Durchfallerkrankungen (verursacht durch Shigella  = Bakterien, die zur Familie der Enterobakterien gehören) verabreicht, die zweite Hälfte erhielt ein Placebo-Präparat. Die Kinder wurden 109 Tage medizinisch beobachtet, in den sich zeigte, dass Durchfälle um 3,8x seltener auftraten als bei unbehandelten Probanden. Mehr noch, es wurde durch das Vorhandensein des anti-Shigella Phagens in Kindern unter 3 Jahren ein deutlich geringeres Risiko für durch eine andere Gattung der Enterobacteriaceae, nämlich der von E. coli Stämmen, ausgelösten Diarrhöe beobachtet.
  • Eine polnische Studie dokumentierte einen >90 % Erfolg bei Sepsis – selbst bei Patienten, bei denen eine Antibiotika-Medikation unwirksam war.
  • Die Rote Armee führte in den Jahren 1982-1983 in unterschiedlichen Teilen der Sowjetunion große Doppelblindstudien zur prophylaktischen und therapeutisch nötigen Wirkung von Phagen durch. Ein zehnfach verringertes Risiko (verglichen mit der Kontrollgruppe) an Durchfall zu erkranken, wurde beobachtet (Brüssow H. Phage therapy: the Escherichia coli experience. Microbiology. 2005 Jul;151(Pt 7):2133-40. Review).

Obwohl heutzutage zahlreiche Phagen-Präparate als Medikamente in Russland zugelassen sind und in Apotheken verkauft werden, wurden klinische Studien nie ausführlich in der wissenschaftlichen Literatur publiziert. Selbst die dafür verwendeten Bakteriophagen, die in diesen Produkten Verwendung finden, wurden ebenfalls nicht detailliert beschrieben. Trotzdem sind unerwünschte Wirkungen selten und schwere Nebenwirkungen praktisch unbekannt. Es tritt auch kein Kollateralschaden an nicht-Phagen-spezifischen Bakterien auf (Denou E, Bruttin A, Barretto C, Ngom-Bru C, Brüssow H, Zuber S. T4 phages against Escherichia coli diarrhea: potential and problems. Virology. 2009 May 25;388(1):21-30).

 

 

 

Phagentherapie – historisch

 

Die Therapie von Bakterien-induzierten Infektionskrankheiten mit Phagen ist ziemlich genau so alt wie die Therapie mit Antibiotika. Beide Behandlungsformen entstanden zu Beginn des 20. Jahrhunderts. Während anfangs mehr Möglichkeiten einer Phagen-assoziierten Methode zur Bekämpfung bakterieller Erkrankungen entwickelt wurden, änderte die Forschung ihren Schwerpunkt in Richtung Antibiotika-Entwicklung vor allem als Penicillin in großen Mengen synthetisiert werden konnte – laut Experten-Meinungen aus dieser Zeit (Fruciano DE, Bourne S. Phage as an antimicrobial agent: d’Herelle’s heretical theories and their role in the decline of phage prophylaxis in the West. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2007 Jan;18(1):19-26.). In der UDSSR soll sie – wie in einigen Publikationen zu lesen ist – aufgrund des Mangels an verfügbaren antibiotischen Substanzen während der Zeit des Kommunismus besonders gefördert worden sein (Phagen sind ubiquitär und daher einfach und günstig verfügbar).

Die Phagentherapie ist seit den 1940er Jahren in Westeuropa und den USA praktisch nicht mehr vorhanden, jedoch in Osteuropa (hier v.a. in den Nachfolgestaaten der ehemaligen Sowjetunion und dort besonders in Georgien) wird sie bis heute noch immer praktiziert. Coliphagen wurden in der Sowjetunion Tausenden Kindern wie Erwachsenen oral verabreicht (auch im Rahmen klinischer Studien), wobei es nie (zumindest nicht dokumentiert) zu schweren Nebenwirkungen kam (Brüssow H. Phage therapy: the Escherichia coli experience. Microbiology. 2005 Jul;151(Pt 7):2133-40. Review).

Erstaunlicherweise ergab aber eine Analyse der Namen von Forschern auf dem Gebiet der Bakteriophagen, dass zumeist englische wie auch deutsche Nachnamen bis heute vorherrschen (Ackermann HW. Who went into phage research? Bacteriophage. 2012 Jan 1;2(1):55-59).

Félix d’Hérelle und seine Kollegen isolierten 1917 im Institut Pasteur in Paris Phagen, die Shigella dysenteriae, Salmonella typhi, Escherichia coli, Pasteurella multocida, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Streptococcus species, Pseudomonas aeruginosa und Neisseria meningitis lysierten, während Twort an Staphylococcus sp. arbeitete. Dadurch wurden die Grundlagen geschaffen, Ruhr, Typhus, Cholera sowie Staphylokokken-Infektionen unterschiedlicher Gewebe (z.B. Haut, Knochen, Auge) zu behandeln. Phagen-Suspensionen wurden sowohl topisch als auch systemisch (oral, intravenös) verabreicht. Zur Vorbeugung von Infektionen wurden Phagen-Kulturen sogar Trinkwasserbrunnen zugesetzt.

Die Wirkung der Phagentherapie (um 1920 – zirka 1940) war so herausragend, dass sie schnell über den Erdball Verbreitung fand: Brasilien (Ruhr), Senegal und Ägypten (Ruhr und Pest), Großbritannien, Italien und Griechenland (Typhus und Paratyphus) sowie verschiedene Anwendungen in China und Japan. Auch Rote Armee und Wehrmacht verwendeten im 2. Weltkrieg zur Behandlung der Soldaten die Phagentherapie (u.a. zur Wundheilung und gegen Durchfallerkrankungen). Große Firmen in Europa (Robert&Carrière, heute Teil von Sanofi) und Nordamerika (Parke-Davis, Lilly, Abbott, Squibb) begannen mit der Produktion und der Vermarktung von Phagen-Therapeutika.

In den Jahren 1945 und 1946 wurde in vitro (Himmelweit F. Combined action of penicillin and bacteriophage on Staphylococci. Lancet 1945;ii:104) und in vivo im Rahmen klinischer Studien (MacNeal WJ, Filak L, Blevins A. Conjoined action of penicillin and bacteriophages. J Lab Clin Med 1946;31:974.) eine Kombinationstherapie mit Penicillin und Phagen erprobt, die sehr vielversprechende Resultate lieferte, da der Wirkung von Phagen und jener der chemischen Substanz des Antibiotikums andere Mechanismen zugrunde liegen.

d’Hérelle gründete 1933 das „Laboratoire du bacteriophage“ in Paris und zwischen 1934 und 1936 – auf Einladung der Sowjetregierung – drei Labore zur Phagenproduktion in Kiew, Charkow und Tiflis, wovon das Letzte bis heute besteht: das George Eliava Institute of Bacteriophage, Microbiology and Virology – IBMV (http://eliava-institute.org/). George Eliava (1892-1937) war ein georgischer Bakteriologe (er leitete ab 1916 bakteriologische Labore und mikrobiologische Institute in verschiedenen Städten) und Freund von Félix d’Hérelle (mit dem er bereits am Institut Pasteur in Paris zusammenarbeitete). Gemeinsam bauten sie das Institut in Tiflis 1936 auf. 
Neben dem Georgischen Institut gibt es auch noch eine große Bakteriophagen-Bank und Forschungseinheit in Breslau/Wroclaw, Polen (http://blogs.evergreen.edu/phage/phage-research/polish-research/). Die Sammlungen der Phagen-Banken werden laufend ergänzt und aktualisiert; die Bakteriophagen werden hinsichtlich ihrer Wirtsspezifität katalogisiert und auf die sich ständig verändernden Bakterienpopulationen wird Bezug genommen (Wirt, Antibiotika-Resistenz, Phagen-Resistenz).

Detaillierte Informationen zur Phagentherapie (mit eindrucksvollen Beispielen der Anwendung) zur Zeit von Félix d’Hérelle finden sich in der Veröffentlichung: Fruciano DE, Bourne S. Phage as an antimicrobial agent: d’Herelle’s heretical theories and their role in the decline of phage prophylaxis in the West. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2007 Jan;18(1):19-26. Hier sind auch jene wahrscheinlichen Antworten auf die Frage definiert wie es dazu kommen konnte, dass die Phagentherapie nahezu gänzlich aus dem Blickpunkt westlicher anti-mikrobieller Forschungstätigkeit fallen konnte, denn sie bot herausragende Vorteile gegenüber der damals (in den Jahren 1920 – 1940) bekannten Möglichkeiten (siehe Tabelle):

 Wirkung der Therapie mit 
 Phagen   Antibiotika 
Effekt auf Gram+ Bakterien + +
Effekt auf Gram- Bakterien (in den Jahren 1920 – 1940) + - (Penicillin gering)
Verhalten nach der Gabe = Titer-Konzentration ↑ (Phagen-Reproduktion) ↓ (Abbau durch Stoffwechsel)
Adaptation an Bakterien + -
Selektivität (Pathogen-Spezifität)
Nebenwirkungen auf den Menschen - +
Herstellungskosten (in den Jahren 1920 – 1940)
Infektionsprävention (in den Jahren 1920 – 1940) + (verfügbar für viele Erkrankungen) - (verfügbar nur für wenige Erkrankungen)

(Tabelle auf der Basis von Informationen aus: Fruciano DE, Bourne S. Phage as an antimicrobial agent: d’Herelle’s heretical theories and their role in the decline of phage prophylaxis in the West. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2007 Jan;18(1):19-26.)

Fruciano und Bourne fassen verschiedenste Motive für das unter Umständen bewusste „Vergessen“ der Phagentherapie von Félix d’Hérelle zusammen. So liegt es sicherlich an den Umständen der Zeit – Kalter Krieg – und hier besonders in der Tatsache, dass d’Hérelle’s Arbeit in der Sowjetunion im Westen die Marke „Stalin’s Therapie“ erhielt, welche außerhalb der kommunistischen Länder mit der Ideologie der Regierungsform in Zusammenhang gebracht wurde. Ebenso war das Wesen von d’Hérelle schwierig und unzugänglich für Diskussionen, v.a. seine Theorien die Immunität betreffend. Er wurde daher von Mitarbeitern des Institut Pasteur wie auch von einer belgischen Arbeitsgruppe angefeindet – es wird spekuliert, ob d’Hérelle nicht aufgrund dieser Kritiken erst in die Sowjetunion ging. Weiters trugen mehr oder minder berechtigte Vorwürfe die wissenschaftlichen Standards von Félix d’Hérelle’s Arbeit betreffend (z.B. sollen Tests zum Teil nicht unter vollkommen kontrollierten Bedingungen durchgeführt worden sein) durch andere Forscher dazu bei, dass das Interesse an dieser Behandlungsmöglichkeit dramatisch nachließ (Fruciano DE, Bourne S. Phage as an antimicrobial agent: d’Herelle’s heretical theories and their role in the decline of phage prophylaxis in the West. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2007 Jan;18(1):19-26).

Félix d’Hérelle fand jedoch auch Anerkennung unter großen Forscherpersönlichkeiten seiner Zeit – so wurde er 28 Mal für den Nobelpreis (Physiologie oder Medizin) nominiert, den er aber nie erhielt:

Nobel Preis Nominierungen von Félix d’Hérelle

Jahr vorgeschlagen von: Jahr vorgeschlagen von:
1924 Fritz Verzár 1931 Eugène Gley – Eugene Opie – G. Reed
1925 R. le Blaye – E Libman 1932 R. Müller – J. Cotte – Karl Kisskalt
1926 Richard Bruynoghe – Hideyo Noguchi – Fr. Berka – V. Neumann – Rudolf Vanysek – O. Völker – Edward Babák 1933 I. Kritschewski
1929 H. Acton – R. Chopre – Marc Romieu – Alexis Carrel – Storm van Leeuwen 1934 E. Schultz
1930 A. Policard – Ivan Hall – Alexis Carrel – E. Libman 1937 Karl Landsteiner

(http://www.nobelprize.org/nomination/archive/show_people.php?id=2649)

 

 

 

 

 

Phagentechnologie – aktuell und zukünftig

 

Wie ist es heute um die Phagentherapie – besonders im Westen – bestellt?

Während es vor allem in Georgien eigene Spezialkliniken für die Phagentherapie und auch, wie bereits erwähnt, ein renommiertes Forschungszentrum gibt, ist derlei weder in Europa noch in den USA vorhanden. Wohl aber gibt es seit 20 Jahren Firmen, die an Phagenprodukten forschen und arbeiten. Schon 2004 fand sich in einer Veröffentlichung von Karl Thiel eine Auflistung verschiedener Unternehmen und ihren Interessensgebieten:

 Unternehmen (Standort)  Gründungsjahr Fokus
Exponential Biotherapies (Port Washington, NY, USA) 1994 Phase 1 clinical trial completed of phage against VRE bacteria; also MRSA phage and biodefense
Biophage Pharma Cancer (Montreal, Canada) 1995 Cancer, infection/inflammation and immune modulation, E. coli as well as Salmonella typhimurium in livestock and carcasses
Phage Therapeutic (Bothell, WA, USA) 1997 Phages against drug-resistant human bacterial infection, now (2004) essentially defunct
PhageTech (Montreal, Canada) 1997 Phage genomics to discover new targets for small molecule antibiotics
Hexal Gentech (Holzkirchen, Germany) 1998 Phages as packages to deliver lethal plasmids to target bacteria
Intralytix (Baltimore, MD, USA) 1998 Phages for environmental, food processing and medical applications
GangaGen (Bangalore, India;San Francisco, CA,USA;Ottawa, Canada) 2000 Nontemperate, nonlytic phage for human therapeutic use; agricultural/environmental applications
PhageGen (Las Vegas, NV, USA; previouslyRegma Bio Technologies of London) 2000 Therapeutic phages and lethal protein delivery
Phico Therapeutics (Cambridge, UK) 2000 Phages to deliver lethal proteins
Phage Biotech (Tel Aviv, Israel) 2001 Lytic bacteriophage technology for clinical, veterinary, agricultural, industrial and ecological applications
MicroStealth Technologies (Cambridge, MA, USA) 2002 Phages as delivery vehicles for antimicrobial peptides
Phage-Therapy (Tbilisi, Georgia) 2002 Provides logistical support for patients seeking phage therapy treatment in the Republic of Georgia
Enzobiotics/New Horizons Diagnostics(Columbia, MD, USA) 2003 Lysin enzymes derived from phage as diagnostic agents and topical therapeutics

(Modifiziert aus: Thiel K. Old dogma, new tricks–21st Century phage therapy. Nat Biotechnol. 2004 Jan;22(1):31-6.)

 

In dieser Aufzählung fehlen Firmen wie z.B. Novolytics (spin-off der University of Warwick, Coventry, UK – gegründet 2002) oder AmpliPhi Biosciences (Richmond, VA, USA – Gründungsjahr: 1989), die beide ebenfalls an Phagen-Technologien feilen. Trotzdem zeigt sich deutlich das gestiegene Interesse an der Entdeckung von Antibiotika-Alternativen bereits zur Jahrtausendwende fern der ehemaligen Sowjetunion.

Derzeit liegt das Problem großteils bei der Zulassung von Phagen-Therapeutika. In der EU und in den USA müsste jeder Phage einzeln zugelassen werden. In den Nachfolgestaaten der ehemaligen UDSSR wurden allerdings seit jeher Phagen-Cocktails verwendet (was auch die Wahrscheinlichkeit einer bakteriellen Resistenzbildung gegen die Verwendung findenden Phagen herabsetzt). So werden dort etwa für eitrige Infektionen 30 Phagen-Stämme gegen 5 verschiedene Bakterien-Typen gebrauchsfertig produziert. Abhilfe im langwierigen und kostenintensiven Zulassungsprozess in Europa und Amerika könnten polyvalente Phagen schaffen, die selbst mehrere lytische Enzyme codiert haben und so nicht nur für einen Bakterienstamm sondern für verschiedene Bakterientypen angewendet werden können (Thiel K. Old dogma, new tricks–21st Century phage therapy. Nat Biotechnol. 2004 Jan;22(1):31-6). Ferner können Lysine aus den Phagen extrahiert und ohne Bakteriophagen verabreicht werden, was wiederum eine Zulassung erleichtern würde. Von einer gemeinnützigen Organisation (www.p-h-a-g-e.org) wurden 32 Bakteriophagen-Experten aus 12 Nationen gebeten, ein Consensus-Papier zur Verwendung von Phagen im medizinischen Bereich zu verfassen. Ziel war es (ähnlich wie bei humanen Geweben und Zellen, die als „non-medicinal product“ in der Europäischen Union definiert werden und so nicht den komplexen Zulassungsprozess wie Arzneimittel durchlaufen müssen), ein Übereinkommen für die Standards bei der Herstellung und Verwendung von Bakteriophagen als „first line“ Breitspektrum Phagen-Cocktail und von Phagen gewonnenen Produkten (wie Phagen-Endolysine) zu finden (Pirnay JP, Blasdel BG, Bretaudeau L, Buckling A, Chanishvili N, Clark JR, Corte-Real S, Debarbieux L, Dublanchet A, De Vos D, Gabard J, Garcia M, Goderdzishvili M, Górski A, Hardcastle J, Huys I, Kutter E, Lavigne R, Merabishvili M, Olchawa E, Parikka KJ, Patey O, Pouilot F, Resch G, Rohde C, Scheres J, Skurnik M, Vaneechoutte M, Van Parys L, Verbeken G, Zizi M, Van den Eede G. Quality and Safety Requirements for Sustainable Phage Therapy Products. Pharm Res. 2015 Jan 14. [Epub ahead of print].

Um Tumorzellen direkt zu behandeln, gleichzeitig jedoch den Organismus im Vergleich zur systemischen Chemotherapie zu schonen und das Risiko sekundäre, durch die Therapie induzierte Tumore zu vermeiden, werden virale Vektoren in vorklinischen und klinischen Studien getestet. Hier wird mithilfe von viraler Nucleinsäure die Expression spezieller (für das Tumorwachstum wichtiger) Gene in Tieren und Menschen unterbunden oder verstärkt. Begonnen wurde die Gen-Therapie bereits in den 1960er Jahren. Für lange Zeit waren nur Eukaryoten-spezifische Viren interessant, da Phagen keine Wirtsspezifität für Eukarya aufweisen. Durch eine Chimärisierung eines Bakteriophagen mit einem eukaryotischen Virus konnte dieses Problem gelöst werden (reviewed von Pranjol MZ, Hajitou A Bacteriophage-Derived Vectors for Targeted Cancer Gene Therapy. Viruses. 2015 Jan 19;7(1):268-284).

Abseits der naturwissenschaftlich-medizinischen Forschung gibt es von Seiten der Nahrungsmittelindustrie großes Interesse am Einsatz von Phagen, da diese nicht riskant für etwaig auftretende Nebenwirkungen beim Konsumenten sind. Bereits ohne Zusatz sind Bakteriophagen in vielen fermentierten Lebensmitteln zu finden: Joghurt, Sauerkraut, eingelegtes Gemüse oder Salami sind nur einige Beispiele dafür (Brüssow H. Phage therapy: the Escherichia coli experience. Microbiology. 2005 Jul;151(Pt 7):2133-40. Review).

Vor nun schon fast 10 Jahren wurde von der US Food and Drug Adminsitration (FDA) ein Bakteriophagenpräparat (ListShieldTM) als antibakterieller Lebensmittelzusatz der Firma Intralyx zur Vermeidung von Listerienbefall von Lebensmitteln (ready-to-eat meat and poultry) zugelassen (Endersen L, O’Mahony J, Hill C, Ross RP, McAuliffe O, Coffey A. Phage therapy in the food industry. Annu Rev Food Sci Technol. 2014;5:327-49 – hier findet sich auch eine Auflistung von Unternehmen weltweit, die Bakteriophagen 2014 kommerziell einsetzen, siehe unten).

Phagen-forschende und Phagenprodukte-vertreibende Unternehmen 2014

Firma (Standort)   Firma (Standort)
AmpliPhi Biosciences Corporation (Bedfordshire, UK) JSC Biochimpharm (Tbilisi, Georgia)
BigDNA (Edinburgh, UK) Neurophage (Pharmaceuticals Massachusetts, USA)
Biophage Pharma Inc. (Montreal, Canada) Novolytics (Coventry, UK)
Biopharm Ltd. (Tbilisi, Georgia) New Horizons Diagnostics (Maryland, USA)
Blaze Venture Technologies (Hertfordshire, UK) OmniLytics Inc. (Utah, USA)
CJ CheilJedang Corporation (Seoul, Korea) Phage Biotech Ltd. (Rehovot, Israel)
EBI Food Safety (Wageningen, the Netherlands) Phage International (California, USA)
Elanco Food Solutions (Illinois, USA) Phage Therapy Center (Tbilisi, Georgia)
Gangagen Biotechnologies PVT Ltd. (Bangalore, India) Phage Works (Fermoy, Ireland)
Gangagen Inc. (California, USA) Phico (Cambridge, UK)
Hexal Genentech (Holzkirchen, Germany) Special Phage Services Pty, Ltd. (New South Wales, Australia)
Innophage (Porto, Portugal) Targanta Therapeutics (Massachusetts, USA)
Intralytix (Maryland, USA) Viridax (Florida, USA)

(Modifiziert nach: Endersen L, O’Mahony J, Hill C, Ross RP, McAuliffe O, Coffey A. Phage therapy in the food industry. Annu Rev Food Sci Technol. 2014;5:327-49.)

 

Probiotische Nahrungsmittel (etwa Joghurts versetzt mit Bifidobakterien- und Laktobazillen-Kulturen) sind längst Normalität in den Kühlregalen der Supermärkte. Nun wäre der nächste Schritt, dass bewusst hinzugefügte Bakteriophagen darin zu finden wären. Diese sollten eine mögliche Dysbalance der Darmflora – so wie sie u.a. bei bakteriellen und viralen Durchfällen vorkommt – korrigieren helfen. Die Firma Nestlé (Nestlé Research Center, Lausanne, Schweiz) forscht ab initio an einer Phagentherapie. Dazu wurde in einer 2004 durchgeführten Studie den 15 gesunden Freiwilligen der Escherichia coli Phage T4 in unterschiedlichen Konzentrationen im Trinkwasser verabreicht. Das Ergebnis: Es traten keine Nebenwirkungen auf, die einen Therapieabbruch erfordert hätten – die Phagenbehandlung wurde gut vertragen. Auch fanden sich weder Antikörper gegen den T4-Phagen noch der Phage selbst im Blut der Probanden (ELISA-Test auf IgM, IgG und IgA mit T4-gecoateten Platten) und die Serumwerte in Bezug auf zwei Leberenzyme (Alanin-Aminotransferase = früher: Glutamat-Pyruvat-Transaminase sowie Aspartat-Aminotransferase = Serum-Glutamat-Oxalacetat-Transaminase = früher Glutamat-Oxalacetat-Transaminase) blieben unverändert. Nachdem der T4 Phage nur eine sehr beschränkte Wirtspezifität für E. coli aufweist, blieben auch die im Darm von gesunden Menschen lebenden symbiotischen Bakterien unbeeinflusst von der Phagentherapie. Daher eignet sich der verwendete T4 Phage selbst (zumindest ohne genetische Modifikation) nicht für eine Behandlung von Durchfallerkrankungen. Dieser Test bezüglich der Verträglichkeit eines T4 Phagen im Menschen war – soweit bekannt – der erste dieser Art in der westlichen Welt. T4 wurde benützt, weil er seit 4 Jahrzehnten in der Forschung verwendet wird und daher bestens bekannt (Genom vollständig sequenziert) und charakterisiert ist (Bruttin A, Brüssow H. Human volunteers receiving Escherichia coli phage T4 orally: a safety test of phage therapy. Antimicrob Agents Chemother. 2005 Jul;49(7):2874-8).

Escherichia coli ist ein besonders interessantes Bakterium für eine Phagentherapie, da es häufig multiple Antibiotika-Resistenzen aufweist. Impfungen dagegen werden zwar versucht zu entwickeln, sind aber noch fern einer Zulassung. Dabei wäre eine adäquate, risikoarme Behandlungsmöglichkeit dringend nötig, da von E. coli ausgelöste Durchfallerkrankungen die dritthäufigste Todesursache bei Kindern in Schwellen- und Entwicklungsländern sind. Außerdem finden sich E. coli Stämme häufig in der Tierzucht, wo sie (wie im humanen Organismus) zu Diarrhöe führen (Brüssow H. Phage therapy: the Escherichia coli experience. Microbiology. 2005 Jul;151(Pt 7):2133-40. Review).

Bakteriophagen sind zudem für naturwissenschaftliche Nachweismethoden und in der medizinischen Diagnostik von Interesse: hier dienen die Viren beispielsweise zur Identifikation spezifischer Bakterienstämme, dabei können sie als Marker für die Anwendung von Antibiotika genutzt werden (Thiel K. Old dogma, new tricks–21st Century phage therapy. Nat Biotechnol. 2004 Jan;22(1):31-6).

Der erste vertriebene Detektionskit war der gegen das Mycobacterium tuberculosis in humanem Sputum-Proben gerichtete FASTPlaqueTBTM (Monk AB, Rees CD, Barrow P, Hagens S, Harper DR. Bacteriophage applications: where are we now? Lett Appl Microbiol. 2010 Oct;51(4):363-9) im Jahr 2003 (Albert H, Trollip AP, Linley K, Abrahams C, Seaman T, Mole RJ. Development of an antimicrobial formulation for control of specimen-related contamination in phage-based diagnostic testing for tuberculosis. J Appl Microbiol. 2007 Oct;103(4):892-9).

Die gegenwärtige kommerzielle Nutzung der Phagentechnologie findet sich in einem Paper von Monk und Kollegen aus dem Jahre 2010 zusammengefasst:

 Unternehmen  Produktname Produktbeschreibung
Biotech Laboratories Lab21 FASTPlaque-ResponseTM Rapid detection of rifampicin resistance in smear-positive sputum specimens containing M. tuberculosis
Biotech Laboratories Lab21 FASTPlaqueTBTM Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in human sputum samples
CheilJedang Corporation BioTector Animal feed for control of Salmonella in poultry
EBI Food Safety LISTEXTM P100 A food processing aid that targets L. monocytogenes strains on food products
Intralytix EcoShieldTM Targets Escherichia coli O157:H7 contamination in foods and food processing facilities
Intralytix ListShieldTM Targets Listeria monocytogenes contamination in foods and food processing facilities
Microphage MRSA ⁄ MSSA Blood culture test Determining of Staphylococcus aureus methicillin resistance or susceptibility directly from blood cultures
Microphage MRSA Screening test Identifies methicillin-resistant Staph. aureus (MRSA) for use in Infection Control programs
Microphage MicroPhage MRSA ⁄ MSSA test Differentiation of methicillin-resistant (MRSA) and methicillin-susceptible (MSSA) Staph. aureus
Omnilytics AgriPhageTM Targets bacterial spot or bacterial speck on crops, with specific formulations for strains of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria or Pseudomonas syringae pv. tomato

(Modifiziert nach: Monk AB, Rees CD, Barrow P, Hagens S, Harper DR. Bacteriophage applications: where are we now? Lett Appl Microbiol. 2010 Oct;51(4):363-9.)

Einen interessanten Einblick auf die vergangenen sowie einen Ausblick auf die nächsten 100 Jahre Phagen-Forschung liefert ein Artikel von Eric C. Keen, in dem er den zukünftigen Einsatz von Phagen in der Landwirtschaft (z.B. bakterielle Resistenzen gegen Spritzmittel und gegen schädliche Bakterien auf den Pflanzen sowie im Ackerboden), Medizin (z.B. neue Impfstoffe, Zerstörung mikrobieller Biofilme, Erforschung der Bedeutung der Viren für den menschlichen Organismus – ähnlich wie die der Bakterienflora) und Biologie (z.B. Evolution der Phagen um neue Strategien gegen virale Pathogene zu entwickeln, natürliches Vorkommen, ökologische Nischen) ebenso wie den weiteren Nutzen in der Molekulartechnologie (z.B. Phagengenome als Quelle neuer Gene und Proteine) darstellt (Eric C Keen. A century of phage research: Bacteriophages and the shaping of modern biology. Bioessays. 2015 Jan;37(1):6-9).

Phagen können relativ kostengünstig produziert werden und so auch in weniger wirtschaftlich gut entwickelten Ländern Einsatz (in der Medizin, Lebensmitteltechnologie, Landwirtschaft) finden (Thiel K. Old dogma, new tricks–21st Century phage therapy. Nat Biotechnol. 2004 Jan;22(1):31-6).

Eine Prophylaxe mittels Phagen gab es in der Sowjetunion bereits nach 1940. Zukünftig kann die Phagen-Technologie für eine Kontaminationskontrolle, zur Vorbeugung von Krankheiten in der Landwirtschaft, und als Infektionskontrolle im Spital verwendet werden (Fruciano DE, Bourne S. Phage as an antimicrobial agent: d’Herelle’s heretical theories and their role in the decline of phage prophylaxis in the West. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2007 Jan;18(1):19-26.).

In der nahen Zukunft wird wohl der Begriff „Bakteriophage“ mit einem probaten, unschädlichen und vielfältigen Mittel zur antibakteriellen Bekämpfung assoziiert sein…

 

 

 

 

Literatur zum Thema (kleine Auswahl):

 

Monk AB, Rees CD, Barrow P, Hagens S, Harper DR.
Bacteriophage applications: where are we now?
Lett Appl Microbiol. 2010 Oct;51(4):363-9.

Rohde C, Sikorski J:
Bakteriophagen.
Naturwissenschaftliche Rundschau. 64. Jahrgang, Heft 1, 2011.

Abedon ST, Kuhl SJ, Blasdel BG, Kutter EM.
Phage treatment of human infections.
Bacteriophage. 2011;1(2):66–85.

Wittebole X, De Roock S, Opal SM.
A historical overview of bacteriophage therapy as an alternative to antibiotics for the treatment of bacterial pathogens.
Virulence. 2014 January 1; 5(1): 226–235.

Endersen L, O’Mahony J, Hill C, Ross RP, McAuliffe O, Coffey A.
Phage therapy in the food industry.
Annu Rev Food Sci Technol. 2014;5:327-49

Abedon ST.
Phage Therapy: Eco-Physiological Pharmacology
Scientifica (Cairo) 2014; 2014: 581639.

Sarhan WA, Azzazy HM.
Phage approved in food, why not as a therapeutic?
Expert Rev Anti Infect Ther. 2015 Jan;13(1):91-101.

Drulis-Kawa Z, Majkowska-Skrobek G, Maciejewska B.
Bacteriophages and Phage-Derived Proteins – Application Approaches.
Curr Med Chem. 2015 Feb 9. [Epub ahead of print]

Verfasser: Dr. Carmen Ranftler

2 Gedanken zu „Bakteriophagen – Forschung und Therapie: Die ersten 100 Jahre

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